El primer establecimiento español fue Santa María de Belén, fundada 1503 por el Almirante CRISTOBAL COLON, quien en su cuarto viaje, quiso dejar una población a fin de asegurar el dominio sobre las costas veraguenses.  Esta población tuvo vida efímera en razón del constante ataque de los indígenas.

        En 1510 DIEGO DE NICUESA, quien fungía como Gobernador de Castilla de Oro, llegó al lugar que COLON había bautizado como Bastimentos, estableciendo una fortaleza a fin de resistir la agresión de los indígenas.  Este lugar fue llamado Nombre de Dios,  el cual posteriormente, jugó un papel importante en la vida colonial del Istmo de Panamá.

        A finales de 1510, los antiguos pobladores de la colonia de San Sebastián, encabezados por MARTIN FERNANDEZ DE ENCISO, VASCO NUÑEZ DE BALBOA y otros, fundaron la población de Santa María de la Antigua del Darién, luego de vencer al Cacique CEMACO.  En esta población se estableció el primer gobierno municipal en América.  No obstante, con la fundación de la ciudad de Panamá, esta población desapareció desde 1524.

        A finales de 1515, el Gobernador PEDRO ARIAS DE AVILA, fundó Acla, puerto en la costa norte del Istmo.  En este lugar fue juzgado y decapitado el Adelantado VASCO NUÑEZ DE BALBOA.    La misma fue abandonada en 1532.  De igual forma, durante la gestión de PEDRADRIAS, se establecieron las poblaciones de Santa Cruz en tierras de POCOROSA y  Los Anades, en territorio de TUBANAMA.   Ambas fueron fundadas por  JUAN DE AYORA, lugarteniente del Gobernador.

        El 15 de agosto de 1519, en la Solemnidad de Nuestra Señora de la Asunción, PEDRARIAS DAVILA funda la Ciudad de Panamá, la cual, según cronistas de la época colonial, rivalizaba en riquezas con Lima y México, ambas sedes de los más grandes virreinatos en América.

        Una expedición dirigida por GASPAR DE ESPINOZA, llegó hasta tierras del cacique NATA.  En ese lugar, dispuso fundar una población, la cual fue destruida por los indígenas en 1531.   Otros conquistadores como HERNAN PONCE y BARTOLOME HURTADO recorrieron las tierras chiricanas, donde fundaron la población de Fonseca, la cual no logro subsistir.