Entre las instrucciones dadas al nuevo Gobernador, se encontraba la de procesar a BALBOA, por su proceder contra el Bachiller MARTIN FERNANDEZ DE ENCISO y el DIEGO DE NICUESA. No obstante, las noticias que PEDRO DE ARBOLANCHA llevó con relación a los últimos sucesos de los descubrimientos, causaron una buena impresión en la Corte.

        La flota del nuevo gobernador arribó a tierras istmeñas en julio de 1514.  En ella, llegó el primer Obispo de Tierra Firme, Fray JUAN DE QUEVEDO, de la orden franciscana, toda vez que Santa María de La Antigua había sido erigida en sede episcopal.   Destacados personajes arribaron con la flota, entre ellos, el Licenciado GASPAR DE ESPINOZA, quien iba a ejercer el cargo de Alcalde Mayor; el cronista GONZALO FERNANDEZ DE OVIEDO; el Bachiller MARTIN FERNANDEZ ENCISO, Alguacil Mayor y Doña ISABEL DE BOBADILLA, esposa del Gobernador y JUAN DE AYORA.

        El Licenciado GASPAR DE ESPINOZA abrió proceso contra BALBOA, quien estuvo detenido mientras se surtía la causa.  Finalmente, se le absolvió de responsabilidad por la muerte de NICUESA, pero se le condenó al pago de indemnización a ENCISO y varias personas.

        Diversos infortunios rodearon la vida en Santa María de La Antigua del Darién, en especial, las enfermedades tropicales a las cuales los españoles no estaban acostumbrados. A pesar de ello, PEDRARIAS dispuso fundar poblaciones en diversos puntos del territorio.

        JUAN DE AYORA, lugarteniente del Gobernador, recorrió con una fuerza de 400 hombres, las tierras de COMAGRE, POCOROSA y TUBANAMÁ.

        En POCOROSA, fundó la población de Santa Cruz, a orillas del mar; mientras que en TUBANAMA fundó Los Anades.  El abuso contra los indígenas, provocó una sublevación general.  POCOROSA degolló a los colonos en Santa Cruz, mientras que el cacique SECATIVA derrotó a AYORA, quien salvó la vida, fugándose con un grupo.

        A fin de salvar el asentamiento de Los Anades, partió una fuerza dirigida por el Capitán ANTONIO TELLO DE GUZMAN, no obstante, se juzgó prudente abandonar la misma. Este capitán prosiguió su recorrido hasta las tierras del cacique CHEPO, a quien derrotó. Prosiguió por tierras de PACORA hasta llegar a un caserío de pescadores llamado Panamá. 

        El Gobernador dispuso efectuar expediciones en el Darién, para lo cual, encomendó a GASPAR DE MORALES y FRANCISCO PIZARRO, quienes llegaron hasta el Mar del Sur. Mediante canoas, atravesaron el mar que separa tierra firme de las islas de Las Perlas, donde vencieron al Cacique TERAREQUI.   Luego siguieron rumbo hasta el sur de Garachiné, donde prosiguieron atacando a los grupos indígenas.

        Una expedición de 130 hombres, comandada por GONZALO DE BADAJOZ, llegó en 1515 al lugar en que DIEGO DE NICUESA fundó Nombre de Dios. Internándose en la región, llegó al Mar del Sur, el cual recorrió a través de las tierras de los caciques PAREQUETE, TABOR, CHAME y CHERU.

        En la región central del Istmo, llegó a tierras del cacique PENONOMÉ, quien huyó a las montañas, mientras que el cacique NATA les facilitó provisiones. La expedición logró vencer a ESCORIA, y recorrió el cauce del actual río Santa María, llegando a la región conocida como Parita, donde gobernaba el cacique PARÍS.

        A fin de alejar a los españoles, el cacique PARÍS le envió tesoros en oro, empero la codicia de los españoles se acrecentó.  Aprovechando la noche, los conquistadores castellanos atacaron el asentamiento del cacique, arrasando con todo objeto de valor.

        PARÍS logró reunir una fuerza que atacó la expedición española, la cual logró arrebatarle los tesoros y esclavos obtenidos durante su travesía.

        Los españoles dirigidos por BADAJOZ, lograron escapar, mediante el uso de canoas, a la isla de Otoque, donde atacó a los indígenas que habitaban dicha isla. Posteriormente se dirigió a la isla de Taboga, donde nuevamente atacó a los naturales. Una vez en tierra firme, logró llegar nuevamente a Santa María de La Antigua.

        A finales de 1515, el propio Gobernador PEDRARIAS DAVILA condujo una expedición, la cual desembarcó en la costa del Norte del Istmo. En dicho lugar, dispuso fundar una población que sirviera de base del camino, con otra población que se fundaría en el Mar del Sur.   A la misma se le dio el nombre de Acla, que en lengua indígena significa "huesos", en razón de la gran cantidad de osamenta encontrada en las llanuras inmediatas.

        Con una fuerza de 200 hombres, el Licenciado GASPAR DE ESPINOZA salió de Santa María La Antigua a fin de someter a los indígenas que habían atacado las poblaciones españolas fundadas en tierras de Pocorosa y Tubanamá. Sin embargo, una vez que tuvo conocimiento de la pérdida de los tesoros por parte de BADAJOZ en manos del cacique PARÍS, se dirige a las tierras de este último a fin lograr recuperar el mismo.

        ESPINOZA logró cruzar las tierras de COMAGRE hasta Chimán, causando graves daños a las tribus por donde pasaba. Prosigue por Chepo y Panamá, continuando su viaje hasta los territorios de NATA, a quien vence.   De igual forma, logra someter a ESCORIA.

        El 6 de agosto de 1516, un contingente dirigido por DIEGO DE ALBITRES, combatieron contra los hombres dirigidos por el cacique PARÍS. Luego de varias horas de ataques, en la cual los indígenas resistieron valientemente, llegó ESPINOZA con el resto de las tropas, logrando las armas españoles el triunfo.

        Posteriormente, el Licenciado ESPINOZA mandó reconocer el territorio que conforman hoy día, las provincias de Los Santos, Herrera y parte de Veraguas.  Una de las partidas reconocedoras lo hizo por la costa, de donde se divisó la isla de Coiba.

        Mientras tanto, en la Corte existían diversas acusaciones contra la forma en que el Gobernador dirigía la administración colonial.  Por ello, la Corona dispuso nombrar a LOPE DE SOSA, como Gobernador y Capitán General de Castilla de Oro a fin de reemplazar a PEDRARIAS DAVILA. Sin embargo, este al llegar a playas istmeñas en mayo de 1520, murió sin ni siquiera haber desembarcado de la nave. Por resolución posterior de la Corte, PEDRARIAS continuó al mando de la gobernación por varios años mas.

        Luego de que la expedición dirigida por GIL GONZALEZ DE AVILA llegase a costas nicaragüenses, en 1524 PEDRARIAS envió al capitán FRANCISCO FERNANDEZ DE CORDOBA a someter no solo a los indígenas, sino al propio GONZALEZ DE AVILA.  Alentado por su éxito, FERNANDEZ DE CORDOBA se rebeló contra el Gobernador PEDRARIAS, quien logró formar una expedición conformada por los habitantes de Panamá y Nata, con todas las armas disponibles.

        En 1526 PEDRARIAS DAVILA llega a Nicaragua, donde somete al rebelde FRANCISCO FERNANDEZ DE CORDOBA, a quien ejecuta en la plaza pública de León.

        Mientras esto ocurre, la Corona nombra a PEDRO DE LOS RIOS como nuevo Gobernador de Castilla de Oro, llegando este a costas panameñas en 1526, con el encargo, entre otras cosas, de procesar a PEDRARIAS, no obstante, con sus influencias, este último logra salir victorioso, obteniendo mediante Real Cédula, expedida en Valladolid el 1 de junio de 1527 el nombramiento de Gobernador de Nicaragua, nueva provincia fundada y separada de Castilla de Oro, sin establecer límites, lo que provoca una confrontación entre ambos gobernadores.